Ospitata al piano nobile di Palazzo dei Diamanti, nelle sale comprendenti il magnifico salone d'onore e l'appartamento cinquecentesco di Virginia de' Medici, la Pinacoteca Nazionale di Ferrara offre una significativa rassegna della pittura a Ferrara dal Due al Settecento: dai grandi cicli di affreschi medievali provenienti dalle chiese di San Bartolomeo e di Sant'Andrea, alle tele seicentesche dello Scarsellino, di Carlo Bononi e del Guercino, fino ai bozzetti dei Gandolfi e dei Crespi.

Notevole è la raccolta di dipinti del Quattrocento, dai preziosi maestri del tardogotico a Cosmè Tura, Ercole de' Roberti e gli altri artefici dell'Officina ferrarese, cui si affiancano artisti forestieri come Gentile da Fabriano, Mantegna e Carpaccio. È parte delle collezioni fin dall'istituzione della Pinacoteca nel 1836 la serie di pale d'altare del Cinquecento provenienti dalle chiese cittadine, fra cui numerose opere di Garofalo – uno dei migliori seguaci di Raffaello in Nord Italia – l'imponente Polittico Costabili eseguito da quest'ultimo in collaborazione con il giorgionesco Dosso Dossi e i drammatici dipinti del Bastianino, con i quali si chiude l'epoca estense a Ferrara.